单细胞 RNA 测序揭示柑橘果实成熟过程中汁胞细胞的 异质性发育轨迹

柑橘是全球最重要的经济水果作物之一，年产量超过1.5亿吨。汁胞细胞是柑橘果实主要的可食部分，是一种高度特化的薄壁细胞，在果实成熟过程中经历剧烈的发育变化，直接决定果实的质地、风味、营养品质和采后耐贮性。然而，传统的bulk RNA测序（bulk RNA-seq）平均了异质细胞群的转录组信号，掩盖了汁胞发育和成熟背后的细胞多样性和动态调控机制。本研究采用高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，对四个关键成熟期：绿熟期（花后90天）、转色期（花后120天）、完熟期（花后150天）和衰老期（花后180天）的柑橘果实（宫川温州蜜柑）汁胞细胞进行了系统的转录组图谱分析。我们共捕获了28，642个高质量的单细胞，通过无监督聚类分析鉴定了8个具有独特基因表达特征的细胞亚群。基于已知标记基因的表达和功能富集分析，将这些亚群注释为：分生组织样前体细胞、早期扩张细胞、液泡发育细胞、糖积累细胞、有机酸代谢细胞、细胞壁修饰细胞、成熟功能细胞和衰老/萎缩细胞。利用Monocle 3和PAGA算法进行的伪时间轨迹分析重建了汁胞细胞的连续发育过程，揭示了一条线性主轨迹（前体细胞 →早期扩张细胞 → 液泡发育细胞 → 成熟功能细胞）和两条次级分支（糖积累分支和有机酸代谢分支），这些分支与果实品质形成密切相关。对不同细胞群和成熟阶段的差异基因表达分析鉴定出12，458个差异表达基因（DEG），这些基因显著富集在细胞扩张、糖转运与代谢、有机酸降解、细胞壁修饰、类胡萝卜素生物合成和激素信号转导等通路中。利用SCENIC和WGCNA算法进行的基因调控网络（GRN）分析鉴定了12个核心转录因子（TF），包括CsMYB77、CsNAC083、CsWRKY42、CsbZIP1和CsAP2/ERF19等，它们在调控汁胞细胞发育和成熟中发挥核心作用。通过瞬时过表达和CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，对三个关键候选基因（CsMYB77、CsNAC083和CsSWEET16）进行了功能验证。结果表明，过表达CsMYB77显著促进细胞扩张和可溶性糖积累；CRISPR/Cas9编辑的CsNAC083株系表现出延迟成熟和细胞壁增厚；沉默CsSWEET16则导致汁胞细胞中蔗糖含量显著降低。本研究首次绘制了柑橘汁胞细胞全面的单细胞转录组图谱，系统阐明了果实成熟过程中的异质性发育轨迹和分子调控机制，为柑橘果实品质的遗传改良提供了宝贵的基因资源和理论基础。